Cuối tháng 8 năm 1940, cậu bé Nguyễn Văn Thuận nhập học tại Tiểu chủng viện An Ninh, tại Cửa Tùng, Quảng Trị. Nhờ sẵn có văn bằng tiểu học certificat d’étude primaire và có trí nhớ tốt và trình độ sinh ngữ và tiếng La tinh, cậu rút ngắn thời gian học từ tám năm xuống sáu năm.[7] Sau khi hoàn tất chương trình tiểu chủng viện, từ năm 1947, chủng sinh Thuận theo học triết và thần học tại Đại chủng viện Kim Long, Huế.[8] Trong thời gian này, ông có dịp tìm hiểu về linh mục José Ramon Manual Pro Juarez và nhận đây là mẫu gương cho đời linh mục của mình. Trong thời gian ba năm đầu tiên của đại chủng viện, chủng sinh Thuận mong muốn được trở thành linh mục triều, nhưng sau đó nhiều lần ông suy nghĩ về việc trở thành một linh mục dòng như các dòng Tên hoặc dòng Biển Đức. Tuy vậy, cuối cùng Nguyễn Văn Thuận tiếp tục ở lại đại chủng viện, học thần học với bề trên chủng viện là linh mục Simon Hòa Nguyễn Văn Hiền.[7]

Ngày 11 tháng 6 năm 1953, Phanxicô Xaviê Nguyễn Văn Thuận được thụ phong linh mục tại Nhà thờ chính tòa Phủ Cam, do Giám mục Jean-Baptiste Urrutia Thi (M.E.P) – Giám mục Đại diện Tông Tòa Địa phận Huế làm chủ phong.[8] Sau khi được chịu chức, tân linh mục Nguyễn Văn Thuận được bổ nhiệm đảm trách vị trí linh mục phụ tá giáo xứ Tam Tòa, Đồng Hới, làm phụ tá cho linh mục Đa Minh Hoàng Văn Tâm.[21][22] Đây là một giáo xứ quan trọng của Địa phận Huế. Linh mục Tâm đã dành thời gian hướng dẫn tân linh mục về các tác vụ mục vụ giáo xứ. Tuy vậy, sức khỏe Nguyễn Văn Thuận kém đi và ông ho ra máu, sau khi thăm khám bác sĩ cho rằng linh mục Thuận có triệu chứng bệnh lao. Linh mục Thuận được chuyển từ bệnh viện Đồng Hới vào Bệnh viện Huế, sau đó lại chuyển viện vào Sài Gòn, nhập viện tại bệnh viện Saint Paul tháng 12 năm 1953. Sau khi chẩn đoán cần cắt phổi bên phải, linh mục Thuận được người quen giới thiệu nhập viện Bệnh viện Quân đội Pháp Grall vào tháng 4 năm 1954. Các bác sĩ tại đây cho biết sau phẫu thuật, sức khỏe Nguyễn Văn Thuận sẽ không hoàn toàn bình phục. Trước khi gây mê vào phòng mổ, Nguyễn Văn Thuận được chụp X quang, và kết quả cho thấy phổi ông đã hoàn toàn bình phục. Nguyễn Văn Thuận cho đây là phép lạ và cảm tạ bà Maria và Thiên Chúa.[7]

Sau khi hồi phục bệnh tình, bốn ngày sau đó, linh mục Thuận trở về Huế và Giám mục địa phận khuyên ông nên nghỉ dưỡng.[7] Sau đó, linh mục Thuận được chuyển đến Giáo xứ Phanxicô Xaviê – Huế, làm phụ tá cho Linh mục Richard Barbon, tên Việt là Triết.[8] Trong thời gian này, ông hỗ trợ mục vụ cho linh mục Richard, kiêm chức Tuyên úy trường Jeanne d’Arc, cử hành lễ cho các nữ tu dòng Thánh Phaolô tại nhà nguyện của trường học này. Ông mời mợi các thợ điêu khắc từ Giáo xứ Tam Tòa đến làm thánh giá bằng gỗ trên cung thánh, hỗ trợ giáo xứ bộ Đàng Thánh giá của gia đình và xây phòng họp cho giáo dân lớn tuổi. Thời làm linh mục phó, giáo xứ này có thêm lễ tiếng Việt vào mỗi chiều Chủ nhật.[23] Bối cảnh sau trận chiến Điện Biên Phủ, linh mục Thuận được yêu cầu chuyển giáo xứ này từ của người Pháp sang của người Việt, do quân đội Pháp rút đi sau chiến tranh. Sau một vài tháng tại giáo xứ Phanxicô Xaviê, năm 1955, sau khi linh mục Richard hồi hương,[23] Giám mục Urrutia lại bổ nhiệm Linh mục Thuận kiêm nhiệm chức tuyên úy của Viện Pellerin, Bệnh viện Trung ương, và các nhà tù tỉnh.[7][19] Linh mục Thuận trước đó đã tình nguyện làm tuyên úy cho các địa điểm nhà tù, nhà thương, trại cùi.[21]

Từ năm 1956 đến năm 1959, linh mục Nguyễn Văn Thuận được cho đi du học tại Phân khoa Giáo luật thuộc Ðại học Giáo hoàng Urbaniana, Roma. Ông hoàn thành việc học và tốt nghiệp với văn bằng tiến sĩ Giáo luật. Luận án Tiến sĩ của ông mang chủ đề: Studium comparativum de organisatione capellanorum militum in mondo ("Tổ chức Tuyên úy Quân đội trên thế giới").[14] Trong thời gian du học, ông có dịp tiếp xúc, sinh hoạt với các phong trào Ðạo Binh Ðức Mẹ, Hướng Ðạo, Cursillos, Focolare. Các phong trào này ảnh hưởng đến đường lối hoạt động của ông sau này.[24] Linh mục Thuận cũng từng viếng thăm Đức Mẹ Lộ Đức vào tháng 8 năm 1957.[7] Ông cũng từng cùng Tổng giám mục Ngô Đình Thục, cậu ruột yết kiến Giáo hoàng Piô XII.[14]

Trở về nước, năm 1960, linh mục Phanxicô Xaviê Thuận được cử làm giáo sư Tiểu Chủng viện Phú Xuân, Huế.Giám mục Địa phận Huế Urrutia Thi cho biết ông gửi linh mục Thuận đi du học là có mục đích, do Giáo hội Công giáo Việt Nam cần nhiều linh mục người Việt và ông cần chuẩn bị để làm lãnh đạo. Giám mục Thi dự liệu linh mục Thuận sẽ trở thành Giám đốc Chủng viện Phú Xuân.[7] Một thời gian ngắn sau đó, ông khởi công xây cất cơ sở mới và thành lập Tiểu chủng viện Hoan Thiện ở ngay thành phố Huế, cạnh trường Thiên Hữu.[24] Từ năm 1962, linh mục Thuận đảm trách vai trò làm Giám đốc Tiểu chủng viện Hoan Thiện. Ông có dự tính mở xưởng nghề trong chủng viện để đào tạo linh mục có lối sống khác biệt, phù hợp với xã hội đang biến đối.[7] Năm 1964, Hội đồng linh mục bầu chọn linh mục Nguyễn Văn Thuận làm Tổng Đại diện Tổng giáo phận Huế. Tổng giám mục Huế Phêrô Máctinô Ngô Đình Thục chính thức chọn ông vào chức vụ này.[8][14]